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《兰州大学》 2019年
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COX2对骨肉瘤MG63细胞转移侵袭迁移的调控及其分子机制探索

 
【摘要】:目的基于PI3K/AKT/NOTCH/Wnt轴探索COX2对骨肉瘤细胞转移及EMT的影响,为抗骨肉瘤药物开发提供分子基础和潜在的分子靶点。方法1采用Ad Easy腺病毒转染系统构建COX2高表达MG63细胞株;并分组为(1)Blank组:不做任何处理的正常培养的MG63细胞;(2)plvx-Ds Red组:感染空载体腺病毒plvx-Ds Red的MG63细胞;(3)plvx-COX2-Ds Red组:感染重组腺病毒plvx-COX2-Ds Red的MG63细胞;细胞免疫荧光实验检测载体是否转染成功;Wetern bloting实验和q PCR实验检测各组细胞中COX2的表达。2细胞分组:(1)Blank组:不做任何处理的正常培养的MG63细胞;(2)plvx-Ds Red组:感染空载体腺病毒plvx-Ds Red的MG63细胞;(3)plvx-COX2-Ds Red组:感染重组腺病毒plvx-COX2-Ds Red的MG63细胞;(4)COX2+NS398组:plvx-COX2-Ds Red组细胞用COX2抑制剂NS398 5μM处理24h的细胞;(5)COX2+EP4A组:plvx-COX2-Ds Red组细胞用4型前列腺素E2受体拮抗剂GW627368X(EP4A)10μM处理24h的细胞。MTT实验检测细胞增殖情况;Transwell细胞迁移实验检测各组细胞迁移能力的变化;Western bloting实验检测各组细胞中β-Catenin、Snail1、vimentin、E-cadherin蛋白表达;q PCR实验检测各组细胞中vimentin、E-cadherin、β-Catenin、Snail1 m RNA表达变化;ELISA实验检测各组细胞上清中MMP2、MMP9、VEGF含量变化。3细胞分组:(1)Blank组:不做任何处理的正常培养的MG63细胞;(2)plvx-Ds Red组:感染空载体腺病毒plvx-Ds Red的MG63细胞;(3)plvx-COX2-Ds Red组细胞:感染重组腺病毒plvx-COX2-Ds Red的MG63细胞;(4)COX2+NS398组:plvx-COX2-Ds Red组细胞用COX2抑制剂NS398 5μM处理24h的细胞;(5)COX2+PI3K抑制剂组:plvx-COX2-Ds Red组细胞用PI3K抑制剂处理24h的细胞;(6)COX2+Notch抑制剂组:plvx-COX2-Ds Red组细胞用Notch抑制剂处理24h的细胞;(7)COX2+Wnt抑制剂组细胞:plvx-COX2-Ds Red组细胞用Wnt抑制剂处理24h的细胞;Tranwell细胞迁移及侵袭实验检测细胞迁移能力的变化;Elisa实验检测细胞上清中MMP2、MMP9、VEGF含量的变化;Wstern bloting实验检测细胞中β-Catenin、Snail1、Vimentin、E-cadherin、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IKK、p-IKK、Notch、Wnt、GSK-3β蛋白含量的变化;细胞免疫荧光实验和Western bloting实验检测细胞NF-κB(P65)、β-Catenin核转录变化情况;q PCR实验检测细胞中vimentin、E-cadherin、β-Catenin、Snail1、Notch1、Wnt3a、Gsk-3β、β-Catenin m RNA含量变化。结果(1)与Blank组相比,plvx-Ds Red组与plvx-COX2-Ds Red组细胞中红色荧光明显增强;plvx-Ds Red组细胞COX2蛋白及其m RNA无显著变化,plvx-COX2-Ds Red组细胞中COX2蛋白及其m RNA均显著性升高(P0.05)。(2)与Blank组相比,plvx-Ds Red组细胞存活率、迁移细胞数、β-Catenin、Snail1、vimentin、E-cadherin蛋白及其m RNA表达量以及上清中MMP2、MMP9、VEGF含量无显著性差异(P0.05),plvx-COX2-Ds Red组细胞存活率、迁移细胞数、β-Catenin、Snail1、vimentin蛋白及其m RNA表达量以及上清中MMP2、MMP9、VEGF显著上升,E-cadherin蛋白及m RNA表达量显著下降,差异有统计学意义(P0.05);与plvx-COX2-Ds Red组细胞相比,COX2+NS398组、COX2+EP4A组、COX2+PI3K抑制剂组、COX2+Notch抑制剂组、COX2+Wnt抑制剂组细胞存活率、迁移细胞数、β-Catenin、Snail1、vimentin蛋白及其m RNA表达量以及上清中MMP2、MMP9、VEGF显著下降,E-cadherin蛋白及m RNA表达量显著上升,差异有统计学意义(P0.05),COX2+NS398组、COX2+EP4A组、COX2+PI3K抑制剂组、COX2+Notch抑制剂组、COX2+Wnt抑制剂组在细胞存活率、β-Catenin、Snail1、vimentin、E-cadherin蛋白及其m RNA表达量以及上清中MMP2、MMP9、VEGF之间相比无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。(3)与Blank组相比,plvx-Ds Red组细胞中PI3K、p-PI3K、Notch1/2/3、Wnt蛋白含量无显著性差异(P0.05),plvx-COX2-Ds Red组细胞中PI3K、p-PI3K、Notch1/2/3、Wnt蛋白含量显著上升,差异有统计学意义(P0.05);与plvx-COX2-Ds Red组细胞相比,COX2+NS398组与COX2+PI3K抑制剂组细胞中PI3K、p-PI3K、Notch1/2/3、Wnt蛋白含量均显著下降,差异有统计学意义(P0.05);COX2+Notch抑制剂组细胞中PI3K、p-PI3K蛋白含量无显著差异(P0.05),Notch1/2/3、Wnt蛋白含量均显著下降,差异有统计学意义(P0.05),COX2+Wnt抑制剂组细胞中COX2、PI3K、Notch蛋白含量无显著变化(P0.05),Wnt蛋白含量显著下降,差异有统计学意义(P0.05)。(4)与Blank组相比,plvx-Ds Red组细胞中AKT、p-AKT、IKK、p-IKK、细胞核中NF-κB蛋白及Notch1/2/3 m RNA和蛋白含量变化无显著性差异(P0.05),plvx-COX2-Ds Red组细胞中AKT、p-AKT、IKK、p-IKK、细胞核中NF-κB蛋白及Notch1/2/3 m RNA和蛋白含量变化显著上升,差异有统计学意义(P0.05);与plvx-COX2-Ds Red组细胞相比,分别将plvx-COX2-Ds Red组细胞中COX2、PI3K蛋白活性单独抑制后,AKT、p-AKT、IKK、p-IKK、细胞核中NF-κB蛋白及Notch1/2/3 m RNA和蛋白含量变化均显著下降,差异有统计学意义(P0.05),二者之间各蛋白的变化无显著性差异(P0.05)。(5)与Blank组相比,plvx-Ds Red组细胞中Wnt、GSK-3β及细胞核中β-Catenin蛋白含量无显著性差异(P0.05);在COX2高表达的plvx-COX2-Ds Red组细胞核中Wnt、细胞核中β-Catenin蛋白含量显著上升,GSK-3β蛋白含量显著下降,差异均有统计学意义(P0.05);与plvx-COX2-Ds Red组细胞相比,分别将plvx-COX2-Ds Red组细胞中COX2、Notch蛋白活性单独抑制后,细胞核Wnt及细胞核中β-Catenin蛋白蛋白含量均显著下降,GSK-3β蛋白含量显著上升,差异有统计学意义(P0.05)。结论(1)高表达COX2蛋白的重组MG63细胞株构建成功。(2)COX2通过激活PGE2受体EP4促进MG63细胞EMT,诱导MG63细胞转移。(3)COX2可通过激活PI3K/AKT/NF-κB通路、Notch1信号通路以及Wnt信号通路对MG63细胞迁移具有促进作用,抑制这三条通路中的任意一条均可抑制由COX2高表达引起的MG63细胞迁移能力的增加。(4)在MG63细胞中高表达的COX2通过激活PI3K通路进而促进Notch受体高表达激活,而Notch蛋白高表达激活后促进了Wnt信号通路的激活,影响MG63细胞中β-Catenin稳定性,上调了MG63细胞中MMP2、MMP9、VEGF以及Vimentin的表达,抑制了E-cadherin蛋白表达,进而促进MG63细胞EMT。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R738.1

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